Интернет-магазин лабораторного и аналитического оборудования
Ваша корзина пуста.

(495) 675-07-05
(495) 675-26-67

(495) 675-26-67


Культивирование клеток без контаминации

Краткий обзор

Контаминация является широко распространенной проблемой при работе с клеточными культурами. Во избежание контаминации требуется хорошая стерильная техника для проведения работ и осторожное обращение с культурами. Немаловажную роль при этом играет CO2-инкубатор, так как он обеспечивает идеальные условия роста не только для клеточных культур, но и для многих нежелательных микробов. Поэтому любой высококачественный CO2-инкубатор оснащен целым рядом функций, предотвращающих контаминацию. Однако при обдуманной покупке CO2-инкубатора нельзя руководствоваться лишь совокупностью его технических характеристик, намного важнее сравнить и оценить общие системы, а также концепции обеззараживания. И тогда станет понятно, что комплексные системы сами по себе не менее безопасны, чем простые. В любой камере должна быть предусмотрена система, быстро и просто предотвращающая контаминацию без использования большого количества расходных материалов.

Значение контроля контаминации при работах с клеточными культурами

Микробиологическая контаминация, вызванная бактериями, грибками или вирусами, таит в себе сложно оценимый риск для работ с клеточными культурами. Загрязнения распознаются зачастую слишком поздно, так как они не всегда видны и не обязательно покрывают выращенные клетки. Более сложные последствия, например изменение важного для клеток человека и млекопитающих значения pH 7,4, возникают в результате поглощения микроорганизмами важных питательных веществ и их выделений в виде продуктов метаболизма, что негативно сказывается на пролиферации клеток. Опасные микоплазменные инфекции, практически никак не проявляясь, могут вызывать изменения в морфологии хозяйской клетки или же изменения на генетическом уровне. Поэтому порой даже один-единственный микроорганизм способен погубить результаты многонедельной или многомесячной исследовательской работы.

Существует множество вариантов возникновения контаминации: например, использование клеточных линий, рабочих сред, сывороток или других реактивов, в которые по воздуху незаметно попали микроорганизмы, недостаточно продезинфицированные приборы или перенос микроорганизмов персоналом лаборатории. Поскольку проверка наличия микроорганизмов зачастую сопряжена с большими затратами, должны быть приняты эффективные меры по контролю контаминации.

Вместе со значительным прогрессом в области выращивания чувствительных клеток, например в сфере тканевой инженерии или регенеративной клеточной/тканевой терапии, возросли также гигиенические требования, предъявляемые к CO2-инкубаторам.

Весь рабочий процесс должен соответствовать высочайшим критериям совершенства и точности, при этом CO2-инкубатору отводится центральная роль. Проблема заключается также в том, что все созданные на основе клеток терапевтические препараты, например суспензия аутологичных хрящевых клеток, предназначенных для реимплантации пациентам, сами по себе не поддаются стерилизации. В то же время директива GMP1 (Надлежащая производственная практика), директива GCCP2 (Надлежащая практика культивирования клеток), а также директива ЕС в сфере донорства клеток и тканей3 рекомендуют использовать одноразовые стерильные изделия или обеспечить возможность стерилизации повторно используемого оборудования при работе с человеческими клетками и тканями. При работе с одной культурой клеток должны быть созданы стерильные условия в течение всего процесса культивации, в противном случае существует не только риск контаминации, но и переноса опасной для жизни пациента инфекции.

Определение понятий: обеззараживание, дезинфекция, стерилизация

Сначала необходимо разъяснить часто используемые понятия «стерилизация», «обеззараживание» и «дезинфекция».

Обеззараживание – широкое понятие, обозначающее удаление опасных загрязнений. Обеззараживание подразумевает устранение биологической, химической и радиоактивной контаминации, но не позволяет судить об эффективности результата.

Дезинфекция играет ключевую роль при создании стерильных условий в медицине. Дезинфекция подразумевает сокращение численности микроорганизмов в ходе конкретного исследования в 510 раз, то есть из 100 тысяч способных к размножению микроорганизмов выживает не более одного.

Под стерилизацией понимается полное удаление опасных для жизни микроорганизмов. Поскольку на деле не удается провести полную стерилизацию со стопроцентной гарантией, в различных фармакопеях установлено общее требование, согласно которому после проведенной стерилизации в одной из миллиона стерилизованных единиц допускается содержание одного колониеобразующего микроорганизма. Благодаря такой крайне низкой вероятности выживания одного микроорганизма стерилизация более надежна, нежели дезинфекция.

В отношении принципа действия и подтверждения эффективности методов дезинфекции и стерилизации4 во всем мире приняты различные директивы и стандарты, которые применяются в первую очередь в фармацевтической промышленности и клинических исследованиях. В фармакопеях различают «классические» методы стерилизации влажным жаром (в автоклаве), сухим жаром (в горячевоздушном стерилизаторе), оксидом этилена и фильтрованием. Пригодность каждого метода зависит от конкретного случая применения и требует валидации с использованием патогенных микроорганизмов.

Меры по предотвращению контаминации в CO2-инкубаторах

Необходимость создания стерильного пространства для культуры живых клеток внутри CO2-инкубатора представляет собой довольно сложную техническую задачу, ведь оптимальные условия роста в инкубаторе способствуют также размножению нежелательных микроорганизмов.

Любая концепция контроля контаминации в CO2-инкубаторе должна учитывать следующие критические аспекты:
  • Высокая степень пригодности внутреннего пространства инкубатора для регулярной дезинфекции опрыскиванием/протиранием, которая является основным методом сокращения общей численности микроорганизмов, то есть микробной нагрузки на систему CO2-инкубатора.
  • Оборудование для полного удаления потенциальных контаминантов в рамках простой и эффективной процедуры стерилизации для устранения всех очагов контаминации, которая проводится через регулярные промежутки времени или по мере надобности.
  • Отсутствие креплений, воздушных каналов, вентиляторов или держателей для вставных полок, которые являются скрытыми источниками контаминации, сложно поддаются очистке и должны извлекаться для проведения стерилизации.
  • Недопущение образования конденсата, который способствует распространению микроорганизмов внутри инкубатора, ведь микроорганизмы размножаются лишь во влажной среде.
  • Исключение переноса микроорганизмов воздушным путем, которые в определенных количествах присутствуют даже в чистых помещениях.

Для исключения контаминации производители CO2-инкубаторов разрабатывают самые различные системы, требующие иногда сложных рабочих процессов, или оптимизируют их с учетом особенностей конкретных CO2-инкубаторов. При этом следует различать меры по обеззараживанию, которые необходимо принимать регулярно или по мере надобности и в ходе которых оборудование выводится на некоторое время из эксплуатации, и системы, которые непрерывно снижают вероятность контаминации в инкубаторе. В таблице 1 представлены самые распространенные меры и методы в соответствующем порядке.

Обеззараживание по мере
необходимости

Постоянная защита от контаминации

Сухой жар при 160 – 180 °C Небольшие бесшовные поверхности
Сухой жар при 120 – 140 °C Ограничение влажности
Влажный жар при 90 – 95 °C Бактерицидный материал поверхности
Обработка газообразной перекисью
водорода
Очистка воздуха фильтром HEPA
УФ-С излучение УФ-С излучение

Табл. 1: Меры и методы минимизации риска контаминации


Стерилизация горячим воздухом при температуре от 160 до 180 °C является единственным из перечисленных выше методов, который отвечает директивам по стерилизации камер, применяемых в медицине и фармацевтике (табл. 2). Программа стерилизации инкубатора состоит из трех фаз: фазы нагрева до максимальной температуры, которая должна быть достигнута во всем внутреннем пространстве, фазы выдержки при максимальной температуре для эффективной дезактивации биологического материала и фазы охлаждения до 37 °C для подготовки камеры к последующей инкубации. В ходе тестирования программ стерилизации CO2-инкубаторов горячим воздухом было доказано полное удаление предписанных контрольных микроорганизмов5.

Различные стандарты и фармакопеи предписывают температуру стерилизации в диапазоне 160 – 180 °C с выдержкой до двух часов. Поэтому метод двухчасовой обработки горячим воздухом при температуре 180 °C превосходит все международные стандарты.

Стандарт Температура Время
выдержки
Британская фармакопея 160 °C 60 мин
Европейская фармакопея 160 °C 120 мин
Японская фармакопея
160 – 170 °C
170 – 180 °C
180 – 190 °C
120 мин
60 мин
30 мин
Фармакопея Скандинавских стран
180 °C 30 мин
Фармакопея США
170 °C 120 мин
Американская Ассоциация Стоматологов
160 °C 120 мин
ANSI/AAMI ST50
160 °C 120 мин
DIN EN 556
(Стерилизация медицинских изделий)
160 °C
180 °C
120 мин
30 мин

Табл. 2: Международные стандарты проведения стерилизации горячим воздухом


Применение сухого жара при температуре 120 – 140 °C хоть и не является полноценной стерилизацией, но ведет к значительному сокращению численности микроорганизмов. Доказано, что горячий воздух, нагретый до температуры 140 °C, уменьшает количество спор Bacillus subtilis var. Niger в 106 раз6.

Дезинфекция влажным жаром при температуре 90 – 95 °C по своей эффективности несравнима со стерилизацией паром в автоклаве при температуре 121 °C. При температуре 90 °C численность микроорганизмов существенно сокращается, однако некоторые термостойкие споры, например, Bacillus subtilis и B. stearothermophilus, полностью не дезактивируются5,10.

Пар перекиси водорода (H2O2) применяется обычно для обеззараживания чистых помещений7. После проведения оптимизированной для CO2-инкубаторов дезинфекции H2O2 требуется надежная и полная дезактивация ядовитого пара H2O2, обладающего цитотоксическим действием, например путем УФ-С излучения.

Уничтожение микроорганизмов путем УФ-С излучения при 253,7 нм: хотя мутагенное действие ультрафиолетового излучения и доказано, эффективность данного метода зависит от непосредственного облучения, ведь глубина проникновения лучей минимальна, поэтому метод подходит лишь для обработки поверхностей. Также была доказана эффективность обработки воды в системах увлажнения CO2-инкубаторов8. Однако Вальхойсер и другие исследователи отмечают уменьшение воздействия УФ-излучения при относительной влажности воздуха > 80 %4.

Применение фильтров HEPA (высокоэффективных фильтров очистки воздуха по частицам) с определенной степенью очистки является официально признанным методом уменьшения концентрации различных частиц в чистых помещениях и ламинарных боксах. Установленный в CO2-инкубаторе вентилятор засасывает воздух через фильтр HEPA, который удерживает частицы определенных размеров. Была доказана определенная эффективность в качестве постоянной защиты от контаминации в CO2-инкубаторах9.

В результате окисления медные поверхности выделяют ионы тяжелых металлов, которые обладают бактерицидным действием и препятствуют размножению бактерий во влажных местах. Однако выделяющиеся ионы меди токсичны также для культивируемых клеток. В ходе серии испытаний было доказано эффективное воздействие сплавов меди/нержавеющей стали на определенные контрольные микроорганизмы8, при этом токсичность напрямую зависит от содержания меди в сплаве12.

Ограничение влажности: с одной стороны, во избежание испарения рабочей среды в CO2-инкубаторе влажность воздуха должна быть на максимально возможном уровне, с другой стороны, во внутреннем пространстве недопустимо неконтролируемое образование конденсата. Поэтому при наличии пассивной системы увлажнения с использованием открытой водной поверхности, которая обычно присутствует в CO2-инкубаторах, требуется ограничение влажности. В идеале излишки влаги должны конденсироваться в определенном месте, которое без труда поддается контролю. Микробы не размножаются на сухих поверхностях.

Простая конструкция: чем сложнее встроенные компоненты и чем больше сумма площадей всех поверхностей во внутреннем пространстве, тем больше затраты на очистку и выше риск контаминации. Поэтому минимизация внутренних поверхностей и отсутствие встроенных компонентов вносят существенный вклад в предотвращение контаминации.

Безопасность рабочих процессов, эффективность и стоимость различных концепций обеззараживания

При борьбе с контаминацией конечному пользователю важны следующие моменты: простота обращения, безопасность рабочих процессов, эффективность и низкие косвенные расходы. Ниже представлен обзор пригодности упомянутых ранее мер и методов (табл. 3), в котором рассматриваются четыре различные концепции с учетом максимальной комплектации оборудования.

    Регулярное обеззараживание

Непрерывное обеззараживание

Риск контаминации

из-за
вентилятора
воздушного
канала
держателя
для вставных полок
Концепция 1

T 180 °C

10 – 12 ч нет нет нет

Концепция 2

F 90 °C

25 ч
да нет да
Концепция 3

T 140 °C

12 – 14 ч Фильтр HEPA
да да да
Концепция 4

H2O2

3 ч УФ-облучение, Cu да да да

Табл. 3: Концепции контроля контаминации (T=сухой жар, F=влажный жар)

Концепция 1 предусматривает лишь бескомпромиссную стерилизацию. Спустя десять часов после начала программы стерилизации, которая запускается одним нажатием кнопки, микробиологически чистый инкубатор готов к дальнейшей эксплуатации, так как не содержит ни единого постороннего микроорганизма. В данной концепции сознательно не предусмотрено использование дополнительного технического оборудования для устранения контаминации, поскольку риск контаминации снижается за счет минимизации поверхностей и отказа от встроенных компонентов. Отсутствие вентилятора уменьшает циркуляцию воздуха во внутреннем пространстве, что снижает риск переноса микроорганизмов по воздуху и делает использование фильтра тонкой очистки излишним. Такая система недорога в использовании, нуждается лишь в минимальном количестве расходных материалов и деталей, не требует длительных или сложных этапов обеззараживания, а потому удобна при работе с инкубатором. Главную роль для пользователя согласно данной концепции играет клеточная культура, а не CO2-инкубатор. Безопасность на высоком уровне, рабочие процессы предельно простые, а текущие расходы низкие.

Цикл обработки влажным жаром согласно концепции 2 занимает, как правило, более 24 часов, после чего обычно требуется калибровка системы датчиков CO2. Конденсат, образующийся при охлаждении водяного пара во внутреннем пространстве, таит в себе риск повторной контаминации обработанных поверхностей, поэтому производитель рекомендует проводить дополнительную дезинфекцию опрыскиванием/протиранием с применением стерильных салфеток. Вентилятор и держатель для вставных полок также повышают риск контаминации и увеличивают затраты на очистку. В целом данная концепция не обеспечивает высокий уровень безопасности, требуя при этом максимально длительного времени простоя.

Концепция 3 предусматривает использование фильтра тонкой очистки, удерживающего микроорганизмы, которые в определенной концентрации всегда содержатся в воздухе. Данный фильтр HEPA лишь отфильтровывает микроорганизмы и споры, которые в последующем удаляются из камеры путем дорогостоящей замены фильтра. Это ведет к увеличению текущих расходов, объем которых зависит от добросовестности пользователя. Для фильтров HEPA нужны вентиляторы и воздушные шланги, которые повышают риск контаминации и увеличивают расходы на техобслуживание, так как они являются скрытыми источниками скопления микроорганизмов и лишь с трудом поддаются очистке. При необходимости обеззараживание внутреннего пространства производится горячим воздухом при температуре 140 °C в течение 14 часов, но это не является стерилизацией. С одной стороны, данная концепция обеспечивает высокий уровень безопасности, так как фильтр удерживает содержащиеся в воздухе микроорганизмы. С другой стороны, это становится возможным лишь за счет использования дополнительных компонентов, которые способствуют появлению очагов контаминации.

Концепция 4 объединяет в себе два общепризнанных метода, применяемых при стерилизации: обеззараживание паром перекиси водорода и УФ-излучение. Обработка паром H2O2 занимает всего три часа и потому является самым быстрым методом обеззараживания, поскольку не требует фаз нагрева и охлаждения. Во избежание опасностей для персонала и клеточных культур к работам с H2O2 допускаются только прошедшие обучение сотрудники. Устройство УФ-излучения, необходимое для дезактивации ядовитой перекиси водорода цитотоксического действия, обеспечивает дополнительное обеззараживание воздушного потока, однако делает внутреннее пространство инкубатора более сложным и уязвимым. Данная система нуждается в вентиляторе, который способствует повышенной циркуляции воздуха и контаминации находящимися в воздухе микроорганизмами. Держатели для вставных полок и воздушные каналы являются скрытыми источниками очагов контаминации. Кроме того, текущие расходы на реактивы H2O2 и УФ-лампы увеличиваются пропорционально объему работ, добросовестно проводимых для предотвращения контаминации. Данная концепция предусматривает максимальные затраты на технические средства, однако обеспечивает минимальное время простоя. Сложное устройство системы делает ее более уязвимой к неисправностям, а текущие расходы по сравнению с остальными тремя концепциями самые большие.

Концепция BINDER по минимизации риска контаминации

В CO2-инкубаторах BINDER реализована единая концепция (см. концепцию 1), которая позволяет быстро и просто проводить повседневную дезинфекцию и несложную аутостерилизацию. За счет отсутствия таких затратных расходных материалов, как фильтры HEPA, УФ-лампы или перекись водорода, обеспечивается регулярное применение данной системы в течение длительного времени. Преимущество концепции BINDER заключается в удачном сочетании следующих моментов:

  • Облегченная рутинная дезинфекция: быстрая и простая очистка бесшовной внутренней камеры без острых углов и кромок, воздушных каналов и креплений в ходе дезинфекции опрыскиванием/протиранием.
  • Бескомпромиссная стерилизация: процедура аутостерилизации горячим воздухом при температуре 180 °C, эффективность которой доказана в ходе исследований, соответствует международным директивам в области медицинского оборудования. Стерилизации подвергается даже современный датчик CO2 с высокоточной ИК‑технологией, который остается в камере (новая серия CB).
  • Существенная минимизация поверхностей: за счет отсутствия таких встроенных компонентов, как держатели для вставных полок, воздуховоды, вентиляторы, фильтры HEPA и УФ-лампы, площадь внутренней поверхности инкубатора, на которой могут осесть микробы и споры, сведена к самому минимуму. 
  • Полное отсутствие конденсата: запатентованная двухстенная система увлажнения создает высокую влажность, удерживая ее на уровне 95 % благодаря функции Cold Spot. Поэтому внутренние стенки и углы камеры всегда сухие.

Выводы

В современных публикациях11 особое внимание уделяется аспекту общей продолжительности процедуры обеззараживания, а также необходимости обеспечения непрерывного обеззараживания. Однако при критическом рассмотрении не стоит забывать о фактической продолжительности процесса, о расходах на дооснащение оборудования компонентами для обеззараживания, нуждающимися в постоянном техобслуживании, а также о затрачиваемом рабочем времени и уязвимости системы.

В настоящем материале было приведено сравнение различных концепций обеззараживания CO2-инкубаторов с точки зрения пользователя. Контаминацию нельзя исключить на 100 %, но можно по-разному помочь пользователю в правильном выращивании клеточных культур. Камера должна быть простой, прочной и надежной, а также обеспечивать безопасность в долгосрочной перспективе. При этом объем затрат в значительной мере зависит от выбранной концепции предотвращения контаминации.

Автор

Д-р Йенс Тильманн является дипломированным биологом и работает в компании BINDER GmbH в должности руководителя отдела по выпуску продукции для выращивания и хранения. Он отвечает за выпуск различных инкубаторов, которые используются в медицине, науке и фармацевтических исследованиях для выращивания культур бактерий и клеток млекопитающих, а также за выпуск морозильных шкафов сверхглубокой заморозки для надежного и длительного хранения чувствительных проб.

Профиль компании

BINDER является крупнейшим в мире специализированным предприятием по выпуску камер для моделирования условий окружающей среды, предназначенных для научных и промышленных лабораторий. Своими техническими решениями предприятие вносит существенный вклад в последовательное улучшение охраны здоровья и повышение безопасности людей. Ассортимент продукции подходит как для повседневных процедур, так и для высокоспециализированных работ в сфере исследований и разработок, производства и контроля качества. Имея в своем штате около 400 сотрудников во всем мире и обладая долей экспорта 80 %, компания BINDER вышла в 2013 году на объем продаж 60 миллионов евро.

Контактная информация

BINDER GmbH
Im Mittleren Ösch 5
78532 Tuttlingen (г. Тутлинген, Германия)
Тел.: +49(0)74 62-20 05-0
info@binder-world.com
www.binder-world.com

Ссылки на международные директивы

Методы стерилизации Британской фармакопейной комиссии. Лондон, Великобритания: прил. X VIII, 2003
Европейская фармакопея 7.0, 2010
Японская фармакопея www.jpdb.nihs.go.jp/jp14e
Фармакопея Скандинавских стран www.dekker.com
Фармакопея США www.usp.com
Американская Ассоциация Стоматологов www.ada.org
Ассоциация содействия развитию медицинской техники (AAMI) www.aami.org
Немецкий институт по стандартизации (DIN) CO2-инкубатор

Источники


1 Leitfaden für die Gute Herstellungspraxis, EU-GMP Leitfaden ISBN-10: 3-934971-24-5 Maas & Peither GMP-Verlag
2 S. Coecke et. al., Guidance on Good Cell Culture Practice, A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture (GCCP), ATLA 33, 261-287, 2005
3 Директива Европейской Комиссии 29/03/2005: Об установлении стандартов качества и безопасности для донорства, приобретения, контроля, обработки, сохранения, хранения и распределения человеческих тканей и клеток
4 K.H. Wallhäußer Praxis der Sterilisation, Desinfektion – Konservierung, Keimidentifizierung – Betriebshygiene, 5. Auflage, 1995
5 P. Distler, 180 °C Hot air sterilization: a safe method against microbiological contamination in CO2 incubators Lab Asia, November 2003, p. 11
6 J. Dalamasso, APEX Laboratories, Effective Heat Sterilization in CO2 Incubators, Vol. 4, Nr. 3, Thermo Electron Corporation’s Heat Sterilization White Paper, 2003
7 D.M.Carlberg, Cleanroom Microbiology for Non-Microbiologists, CRC Press, 2005
8 H. Basujima, D. Mistry, Technical Development Report, Sanyo Electric Biomedical Co., Ltd. A Comparative Analysis of Ultraviolet Light Decontamination versus High-Heat Sterilization in the Cell Culture CO2 Incubator, with the Use of Copper-Enriched Steel Construction to Achieve Background Contamination Control™, 2007
9 A. Campbell, D. Figel, Importance of Class 100 Air in a CO2 Incubator, Vol. 4, Nr. 1, Thermo Electron Corporation’s Class 100 Air White Paper, 2003
10 Bio safety Investigation Unit, CAMR, Efficacy of a CO2 incubator heat disinfection cycle on dried microbes, 1998
11 Schaffung eines sicheren Umfelds für Zellkulturen in biopharmazeutischen Anwendungen, White Paper Panasonic, Laborpraxis September 2013
12 H.T. Michels, Anti-Microbial Characteristics of Copper; ASTM Standardization News, Oktober 2006; www.tellurex.com

К списку статей